生物等效性研究现状概述

皖南医学院弋矶山医院药物临床评价中心　李娟　谢海棠　郑青山

　　摘要:本文从试验设计、样本含量的估计、受试者的选择以及生物等效性评价方面综述了目前国内外生物等效性研究的现状,总结了生物等效性评价的各种统计分析方法,并提出了一些存在问题。
　　关键词:生物等效性;试验设计;统计分析方法
　　 生物等效性[1](bioequivalence)是指同一种药物的不同制剂在相同实验条件下,给予相同的剂量,其吸收速度和程度没有明显差异。生物等效性试验在新药开发和新药评价过程中发挥着非常重要的作用。在开发已经临床试验证实疗效和安全性的已上市药物的新剂型、证明新剂型与原剂型是否生物等效;在创新药专利过期后,开发其仿制药物,证明仿制药物与创新药物是否具有等同的有效性和安全性;另外,在新药获准上市后其制剂包括处方和工艺又经过大幅度改变情况下,在所有这些情况下,通常均不需要重复临床试验去确认试验制剂的安全性和有效性,只需进行生物等效性试验,通过比较受试药品与参比药品药动学参数的等同性,推断两种药品将产生类似的治疗效果。生物等效性研究的目标是要证实等量同种药物的两种制剂生物利用度完全相同,最终使得在替换使用相关的两种制剂时具有相同的有效性和安全性。本文针对生物等效性研究中设计与统计和一些有待解决的问题作简要概述。
1　生物等效性的分类
从等效性的程度来看有三种:平均生物等效性(average bioequivalence, ABE),群体生物等效性(population bioequivalence, PBE),个体生物等效性( individual bioequivalence,IBE)。
1.1　平均生物等效性　人群使用T药物与使用R药物所得效应,其平均值相同。ABE虽然保证平均效应相同,但不一定保证效应的变异度相同,即两总体的均值相同,但方差不一定相同。
1.2　群体生物等效性　人群使用T药物与使用R药物所得效应,不仅其平均值相同,而且效应的变异度相同,即两总体的边缘分布相同。PBE虽保证其边缘分布相同,但对每个个体而言,使用T药物与使用R药物所得效应不一定相同。即个体与药物间可能存在交互作用(subject-by-formulation interaction)。
1.3　个体生物等效性　对每个个体而言,使用T药物与使用R药物所得效应值接近。显然,如果个体等效,则群体等效;如果群体等效,则平均等效。反之不然。从等效的程度来讲,IBE最强, PBE其次,ABE最弱。从应用的角度来讲,两个具有个体生物等效性的药物,具有用药可交替性(switchability),即某患者在服用某药物一段时间后,如果改用另一个与之具有个体等效性的药物,可以得到同样的效果;而具有群体生物等效性的药物,具有处方可选择性(prescribability),即医生在给患者初次开药时可以任意选用,这对于该类患者群体来说效应是相同的。
2　生物等效性的研究设计[2]
2.1　试验设计
2.1.1　非重复试验设计　用于ABE或PBE研究。
(1)交叉试验设计序　　列1 TR
　　　　　　　　　　序列2 RT
(2)平行组设计即　　　组1 T
　　　　　　　　　　组2 R
2.1.2　重复试验设计[3]　三种生物等效性研究都可以用此种设计但ABE或PBE研究时不一定必须,而IBE研究时由于要估计个体内方差以及个体与药物的交互作用,所以必须用重复试验设计。
(1)四时期的重复交叉设计在四个时期中,两种药物T、R按两个或四个序列进行试验。常用的设计有:
　序列1 TRTR　　　或　　　序列1 TRRT
　 序列2 RTRT　　　　　　　序列2 RTTR
(2)三时期的重复交叉设计在三个时期中,两种药物T、R按两个序列进行试验。常用的设计有:
　 序列1 TRT　　　或　　　序列1 TTR
　 序列2 RTR　　　　　　　序列2 RRT
2.2　样本含量的估计[4,5]　受试者例数应当符合统计学要求,对于目前的统计方法, 18~24例可满足大多数药物对样本的要求,但对于某些变异性大的药物可能需要适当增加例数。
一个临床试验的例数多少是由三个基本因素决定的[1]:
(1)显著性水平:即α值的大小,通常取0. 05%或5%; (2)把握度:即1-β值的大小,一般定为不小于80%,其中β是犯第II类错误的概率,也就是把实际有效误判为无效的概率;(3)变异性(CV% )和差别(θ):两药等效性检验中检测指标的变异性和差别越大的需例数越多。在试验前并不知道θ和CV%,只能根据已有的参比制剂的上述参数来估算或进行预试验。另外,当一个生物利用度试验完成后,可以根据θ、CV%和把握度等参数来求N值,并与试验所选择例数进行对比,检验试验所采用例数是否合适。
2.2.1　ABE研究的样本含量　我国《新药审批办法》(1999)和2002年《药品注册管理办法》(试行)规定进行ABE研究时的样本含量一般为18~24例。必要时应按照研究设计和统计原理计算所需的样本含量。
2.2.2　PBE、IBE研究的样本含量　由于评价PBE、IBE的统计量是由效应值的均数、方差、个体内的方差以及个体与药物的交互作用组成的,因此样本含量的估计是基于模拟数据产生的。该模拟系统模拟的数据其试验制剂与参比制剂的平均等效性在方差和药物与个体之间的交互作用相同的情况下,其变异度不超过5%,该样本的检验效能应达到80% ~90%。样本含量还与变异度的大小以及试验的设计有关。在生物医学文献和/或初步研究中可通过方差的估算查找某一药物受试者的例数。
研究者应该纳入足够多的受试者以免发生脱落,因为试验中替代受试者将会使统计分析和模型复杂化,一般来说脱落受试者最好不被替代。研究者如果必须要用新的受试者替代脱落者需在试验记录中解释原因,并要解释受试者样本是否来自替代者,如果不是,要测定该替代样本。如果脱落率高,研究者需加入更多的受试者,则需修改统计方案。其他受试者不应在数据分析结束后纳入分析除非试验开始即为一个序列的或成组序列的试验设计。
2.3　受试者的选择[7]　关于受试者的选择,不同国家的生物等效性研究指南中对招募受试者的条件、要求存在一定差异,如在年龄、性别、体重、是否吸烟等方面的要求不同,对研究群体基因多态性的考虑也不一致。从维护受试者的安全角度考虑,有些国家要求在进行全新药物(NCEs)的生物等效性研究时,必须测定受试者的表型,对于仿制药物,如果已知该药物代谢不存在基因多态性,则不要求测定其表型,如果已知其代谢存在基因多态性,在进行单剂量或多剂量研究之前需要确定受试者的表型,从伦理方面考虑,不应招募弱代谢者参与多剂量研究。另外,为了减少研究结果的变异性,对受试者的表型也必须作出要求。关于受试者的性别,在WHO、欧盟、美国和日本等国家均要求同时选择男性和女性,在我国则要求只选择男性。有关受试者的例数,不同国家也有不同要求。目前,有关受试者的选择还缺乏国际的一致性标准。
2.3.1　健康受试者[1]　生物等效性研究受试人群的选择应尽可能一致,通常选择健康受试者以减少非受试药物引起的变异、应制定明确的入选/剔除标准,一般应选用男性受试者。
年龄在18~40周岁。同一批受试者年龄不宜相差10岁以上。体重应在标准范围内,且同一批受试者体重(公斤)不宜悬殊过大。因试验中不同受试者服用药物剂量相同。标准体重=[身高(cm)-80]×0. 7或[身高(cm)-170]×
0. 6+62,一般要求在标准体重±10%范围内。
2.3.2　有适应证的患者　如果由于活性药物已知的不良反应可能对健康人产生难以接受的药理学反应和危险,有必要使用治疗中的病人进行试验,这种改变应由申办人予以解释。
2.3.3　遗传表型　为安全起见,应考虑受试者的遗传表型和/或遗传型,并探索受试者间的主要差异。
2.4　生物等效性评价的参数　FDA要求以生物利用度试验获得的制剂的AUC(药时曲线下面积)、Cmax(峰浓度)、tmax
(达峰时间)、t1/2(半衰期)等药代动力学参数来估计药物的生物等效性,其中AUC反映药物的吸收量,它是估计其他参数的基础;Cmax、tmax反映药物的吸收速率; t1/2反映药物的代谢情况。随着生物等效性评价的发展,现已有人对这些参数提出异议,并提出了一些新的评价生物等效性的参数[5]。
3　各种生物等效性的评价的统计方法[7]
3.1　评价思路　评价平均生物等效性即是比较效应值的平均水平是否接近。其评价准则为
　　　 (μ_T-μ_R)²≤CA　　式1
其中,μT、μR分别为T、R效应值的总体均数,CA为平均等效限(ABE limit)。
在评价群体生物等效性时,既要考虑T和R的平均效应,又要考虑T和R效应值的方差。其评价准则为:
　　　 (μ_T-μ_R)²+(σ_TT²-σ_TR²)≤CP　　式2
其中,σTT2、σTR2分别为T、R效应值的总体方差。CP为群体等效限(PBE limit)。
　　 在评价个体生物等效性时,除了考虑上述T和R的平均效应及方差,还要考虑个体与药物间的交互作用。其评价准则为:
　　　 (μ_T-μ_R)²+σ_D2+(σ_{W T}²-σ_{W R}²)≤C1　　式3
其中,σW T2、σW R2分别为T、R效应值的个体内方差(within-subject variability),σD2为个体与药物的交互作用。
C1为个体等效限(IBE limit)。
由上可见,不同的生物等效性要求不同,考虑问题的角度不同,因此,评价时考虑的因素亦不相同。上述式1~3中,方程的左边可以根据样本估计,而方程右边的等效限需要事先给出。不同的思维或指导思想确定的等效值,就形成了不同的方法。
3.2　平均生物等效性统计方法
3.2.1　方差分析法　这是一种比较传统的分析方法,因为其检验结果只能满足“是”与“否”,样本容量也较少,所以不能满足需要。但是,方差分析法可获得生物等效性的初步评价,且是Westlake法、Bayesian等法检验方法的基础,因为它们都要用到方差分析中算出的标准差。
3.2.2　Westlake法[9, 10]　这种方法需要建立对称区间(μs-Δ,μn+Δ),其中,

Δ=k1s　 n　　 2-(Xs-Xn) 　或Δ=k2s　 n　 2-(Xs-Xn)　　 式4
　　 式中Xs和Xn分别表示标准品和待测品的样本均值;μs,μn分别为总体均值; s为样本标准差,由方差分析算得; k1, k2为常数,其值的选取与以k1、k2积分上下限的t分布的概率积分有关。根据具体的要求,在确定k1, k2后,带入公式求得△再确定对称区间,根据Xn是否落在区间内,进行生物等效性评价。
3.2.3　Bayesian法[11, 12]　若待测制剂的参数均值XT与参比制剂的参数均值XR之比θ(θ=XT-XR)介于生物等效区间r1和r2之间(r1≤θ≤r2)的后验概率Pr(posterior probability)足够大,则可作出生物等效的评价,否则,两者不等效。θ= XT/XR位于等效区间的后验概率按下式计算。

Pr(r1≤θ≤r2) = ABtv(τ)dτ　　式5
A =(XT-r1XR) n　 s1+r12　　B =(XT-r2XR) ns1+r22　　　式6
　　 式5中tv(τ)指自由度为v和t分布密度函数, n为样本数,式6分布的积分运算比较复杂,应用时可查阅有关t分布计算表。
Bayesian法Westlake法之间的关系:当P>1-a,意味着(1-a )的Westlake置信区间在(r1, r2)之内,为置信水平。
3.2.4　双单侧t检验法[13~15]　1986年美国FDA要求在药品生物利用度研究的等效性检验中,使用双单侧检验( two onesided tests procedure)。我国药学和统计学家也相继认同和广泛使用了此法,其假设检验为
　　　　　　　 H0:μ_T-μ_R≤-θ　或　μ_T-μ_R≥θ,H1: -θ<μ_T-μ_R < θ
式中μT和μR可分别指总体待测品和参比品的平均生物利用度参数,θ的值即为等效界值,FDA建议,μT和μR的差值在ln(8/10)到ln(10/8)之间,即
　　　　　　　　ln(0.8) <μT-μR< ln(1.25)
　　 μT和μR是总体均数,可以用样本均数估计。实际评价时,如果两样本(对数值)均数之差值的90%可信区间在( ln0. 8, ln1. 25)之内,则认为,T与R具有平均生物等效性。
3.2.5　(1-2α)%置信区间法[16]　该法可按照以下公式计算。
　　　　　　　90% CI=lg-1(μT-μR±tα, df·Se×100% )　 (对数转换)
　　 若求出的90% CI处在等效范围80% ~125%之间,则两制剂生物等效,若超出此等效范围,则可视为不等效。此即所谓80/125规则。(1 - 2α)置信区间法中所谓2α,指试验中总的显著性水平,即其预定显著性水平为两侧各为0. 05。本法与双向单侧t检验在生物等效性评价中具同等价值。美国FDA于1995年规定采用这一统计方法评价药物制剂的生物等效性。
3.3　群体及个体等效界值及相关参数的确定　生物等效性的评价是基于药代动力学参数AUC、Cmax、tmax的,由于这些参数的观察值分布为非正态分析,故FDA建议,在进行分析前先对AUC、Cmax等作对数变换,再对变换后数据进行分析。为方便起见,下标T和R分别表示T和R的效应。
3.3.1　群体生物等效性等效界值的确定　FDA建议, CP取值为: ( ln1. 25)2+εP。如果σTR2较大,σTR2>σT02,则CP=σTR2/σT02[( ln1. 25)2+εP]。
式6又可表示为:

　　　PBC =(μT-μR)2+(σTT2-σTR2) max(σT02,σTR2)<θP=(ln1.25)2+εPσT02　　　式7
等价于:
　　　ηP= (μT-μR)²+(εP)-θPmax(σT0²,σTR²) <0　　　式8
其中,σT02为控制总方差的参数,常取0. 22。εP为常数。如果σTR2≤σT02,式7左边分母为常数,称为常数标度(Constant-Scaled);如果σTR2>σT02,式7左边分母为σTR2,称为参比剂标度(Reference-Scaled)。即,参比剂标度用于变异度较大的药物(CV大于30%,如环孢霉素),常数标度用于变异度较小的药物(如茶碱)。εP的取值要考虑方差项(εP)的大小。
FDA认为,申办者打算采用群体生物等效性方法评价时,应与管理部门联系,以获得有关εP和CP的信息。
实际评价时,如果样本ηP的95%可信区间上限小于0,则认为群体等效性成立。关于ηP的可信上限的计算见文献[6]。但在进行PBE分析前,首先要求ABE成立。
3.3.2　个体生物等效性等效界值的确定　BE界值的确定与PBE类似。CI取值为: ( ln1. 25)2+εI。
如果σW R2较大,σW R2>σW 02,则
　　 CI=σW R2/σW 02[( ln1. 25)2+εI]。
式3又可表示为:

　　 IBC=(μT-μR)2+σD2+(σW T2-σW R2) max(σW 02,σW R2)<θI=( ln1. 25)2+εI σW 02　　式9
等价于:ηI= (μT-μR)2+σD2+ (σW T2-σW R2) -θImax (σW 02,σW R2)<0　　式10
　　 其中,σW 02是控制个体内方差的参数,常取0. 22,εI为常数。如果σW R2≤σW 02,为常数标度;σW R2>σW 02时为参比剂标度。同样,申办者打算采用人体生物等效性方法评价时,应与管理部门联系,以获得有关εI和CI的信息。
实际评价时,如果样本ηI的95%可信区间上限小于0,则认为个体等效性成立。关于ηI的可信上限的计算见文献[6]。在进行IBE分析前,首先要求ABE和PBE成立。
3.4　数据变换　FDA(2001)建议,AUC等药代动力学参数的生物等效性评价应在对数尺度下进行。因为: (1)通常情况下,AUC或Cmax呈正偏分布且方差不齐,对其作对数变换可以改善其分布的偏性,缩小方差间的差异; (2)药代动力学进行对数变换的理论基础为:转换后的数据可以用加法模型进行处理。例如,若发生中央室一级排除,方程为: lnAUC0-∞=lnF+lnD-lnV-lnKe(F为吸收分数; D为吸收量;V为表观分布;Ke为排除率常数)。
3.5　参数的估计[6]　等效性评价中,各方差分量的估计,FDA推荐采用矩法(Method ofMoments);在有缺失数据时,推荐采用限制性极大似然法(RestrictedMaximum LikelihoodMethod)估计。FDA在其公布的指导原则中专门介绍了估计方法。
4　生物等效性研究中的其他问题[17]
4.1　生物等效性研究中的立体异构问题　据估计,在目前临床使用的药物中超过1/4以上的药物为手性药物,其中以单一对映体上市的药物很少,多数药物则是以外消旋体形式给药。在不同药物的外消旋体中其对映异构体的药理活性可能存在显著差异,使用常规的非立体专属性方法评估生物等效性难以保证实验制剂与参比制剂在治疗上等效。立体异构在生物利用度和生物等效性研究中应受到足够重视。在1992年生物等效性国际会议的报告[18]中声明,如果两种对映体的全身利用度和全身清除率已有资料证实无差异,可使用非立体专属性方法评价,否则,应使用立体专属性方法。Srinivas NR等[19]对β-肾上腺素受体阻断剂nadolol的两种制剂进行了生物等效性研究,该药物具有两个手性中心及4个光学异构体,它们与膜表达的β-肾上腺素受体结合的亲和力不同,在给予nadolol单剂量和达稳态后进行立体选择性和非立体选择性生物等效性研究,以lnCmax和lnAUC为生物等效性考核指标,报道在单剂量情况下,按总的药物及光学异构体之一SQ12150评估为生物等效,而按其它三种光学异构体评估均不等效,在稳态情况下,按总的药物评估为生物等效,而使用立体选择性方法评估则未能获得等效结果。这篇报道首次提供证据证明对于手性药物的生物等效性研究应该使用立体选择性方法。
4.2　体外溶出试验在生物等效性评估中的作用　生物等效性评估通常要求必须通过人体试验进行但体外溶出试验在生物等效性评估中也具有一定作用。WHO的生物等效性研究指南[20]允许利川体外溶出试验评估某些药物的生物等效性,该指南中规定,当体外和体内相关性能够被证实,特别是当试验制剂和参比制剂在体外的溶出速度很快(15min内溶出度不低干80% )的情况下,可以利用体外溶出试验结果来推测药物在体内的生物等效性,但该指南也指出,体外溶出试验在生物等效性评估方面应尽量少用。在日本的生物等效性研究指南中,将体外溶出试验用于选择受试者、试验制剂和参比制剂,另外还将其用于个体内变异很大的药物生物等效性的评估。
体外溶出试验方法简便,试验条件可以严格控制,所得结果准确可靠,而人体内的生物等效性试验其结果要受到多种因素影响,情况复杂和多变,难以预测和控制。人们希望能够利用药物体外释放过程来替代体内的吸收过程,但必须首先证明药物体外溶出和体内吸收是否存在相关关系。
4.3　食物效应问题　考虑到多数药物都是在餐后给药的实际情况以及药品生物利用度的食物效应,在生物等效性研究中阐明生物利用度的食物效应是极为重要的。在研究方法上,通常是将实验制剂与参比制剂在相同的条件下按单剂量给药进行研究,可以采用四期交叉设计方法对两种制剂在禁餐和餐后分别给药进行研究,另外,也可以进行两项独立的两期交叉研究,即在禁餐和餐后对两种药品分别进行生物等效性评估。目前各个国家在建议要求进行餐后给药研究的制剂类别及餐后给药研究的方法上还存在差异。FDA发表了关于生物利用度和生物等效性研究中食物效应研究的草案指南[21],其中规定了评估食物效应的研究方法,以及速释片和缓释片需要进行食物效应研究的情况:新药的开发过程、新药获批准后的改变以及仿制药品的批准申清,规定在这些情况下必须进行食物效应研究。
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